脊髓性肌（jī）萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一（yī）种常染色体隐性遗传病，居儿（ér）童致死性常染色体隐性遗（yí）传（chuán）病的（de）第2位。位于染色体5q11.2～q13.3上的运动神经元存活基（jī）因（yīn）（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主（zhǔ）要致病（bìng）基因。

　　人基因组有（yǒu）两个紧邻的高度同源的SMN基因：端粒侧的SMN1和（hé）着丝（sī）粒侧的SMN2，两者仅有5个碱基不同。SMN1是主要功能基因，该基因突变可导致SMA发（fā）病，SMN2为临床表型的调节基因，影响病情的严重程度，其拷贝数增加可减轻（qīng）SMA表型。目（mù）前（qián）已知约94％的SMA患者为SMN1基因（yīn）第7和（或）第8外显子纯合缺失所致（zhì），少数病例（lì）可由SMN1基因点突变或小的缺失引起。

　　SMN1基因外显（xiǎn）子缺失检测的（de）意（yì）义

　　SMA在人（rén）群中（zhōng）的发病率为（wéi）1/5000～1/10000，群体携（xié）带者频率为1/35～1/50，是出（chū）生缺陷的高危因素，因（yīn）此极有必要进行SMA携带者的人（rén）群筛（shāi）查（chá），并通过产（chǎn）前诊断（duàn）技术降低人群中SMA患（huàn）儿（ér）的出（chū）生率。

　　临床上将SMA分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即婴（yīng）儿型、中间型和少年（nián）型，严重程度（dù）依次递（dì）减。神经（jīng）专科医生一般根据患者发病年龄（líng）、临床表现及病（bìng）情进展程度进行临床诊断，辅助（zhù）检（jiǎn）查方法包（bāo）括肌电（diàn）图、肌酶和（hé）肌肉活检，结合家族（zú）史和SMN1基因分析（xī）可进（jìn）行确（què）诊。由于（yú）SMA患（huàn）儿中约94%为（wéi）SMN1基因外显子纯（chún）合缺失，因此，SMN1基（jī）因缺失检测对于SMA的诊断具有更高的灵敏度和特异性。且（qiě）对不同型的（de）SMA患者，SMN1纯合缺失率（lǜ）没有显著（zhe）差异，所以，SMN1纯（chún）合（hé）缺失的（de）检测对于不同型SMA患者具有相同的临床诊断（duàn）价（jià）值。在欧（ōu）美人群中，SMN1基因纯合（hé）缺失检测（cè）已成为诊断和（hé）排除诊（zhěn）断SMA的首选方法。

　　SMN1基因缺（quē）失检测试剂的（de）现状

　　目（mù）前，SMN1基因外（wài）显子缺失检（jiǎn）测试剂（jì）较为缺乏，临（lín）床检验实验室较为公（gōng）认的方法是PCR结合（hé）限制性片段长度（dù）多态性（PCR-RFLP）的（de）方法。但该方（fāng）法操作较为繁（fán）琐，且重复性差，不利（lì）于标准化，不易推广。同时（shí），这（zhè）种方法只能检（jiǎn）测（cè）出纯合缺失，无法确（què）认杂（zá）合缺（quē）失。

　　荷（hé）兰的SMAMLPA检测试剂可（kě）对待（dài）测靶序列（liè）进行半定（dìng）量分析，因（yīn）此既可（kě）检测纯合缺失，亦可确认杂（zá）合缺失。在国内外（wài）已有多篇文献报（bào）道（dào）采（cǎi）用该方（fāng）法进行SMA患者（zhě）诊（zhěn）断和SMA携带（dài）者筛查（chá）。但该产品目前仍（réng）为“仅用（yòng）于研究（jiū）”的试剂，尚未按照体外诊（zhěn）断类医（yī）疗器械上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国（guó）家（jiā）食品药（yào）品监管总（zǒng）局批准了第一（yī）项SMN1缺失突变检（jiǎn）测试剂上市（shì）。该产品采用多重实时荧光MGB-TaqMan探针（zhēn）PCR法（fǎ），以人基因（yīn）组单（dān）拷贝（bèi）基因RPP40为内参基因，对SMN1基因第7外显子和第8外显子拷贝数进行相对定量检测，用（yòng）于SMA患者的（de）体（tǐ）外辅助分子（zǐ）诊断。SMN1基因外显子缺失检测的难点（diǎn）之一（yī）在于排除高同源（yuán）性基因SMN2的干扰，特别是对于SMN2高拷（kǎo）贝数的受试者，需保证结果的准确（què）可靠。该产品通（tōng）过对实时（shí）荧光PCR相对定量（liàng）、绝对（duì）定量技术进行（háng）系统整合（hé），并在反应体系中加入特定（dìng）化学组（zǔ）分，以抑制PCR引物3’端的胞嘧（mì）啶（dìng）（C）与胸腺嘧（mì）啶（T）的（de）错配（pèi），增加PCR扩增（zēng）的特异性（xìng），从而有效控制SMN2基因非特异性扩（kuò）增对检（jiǎn）测结（jié）果的影响（xiǎng），准确检出高拷贝数SMN2样本中（zhōng）SMN1基因第7和第8外显子（zǐ）的缺失情况。

　　鉴于国内外尚无任何按（àn）照体外诊断试（shì）剂批（pī）准上市的SMA分子诊断（duàn）产品，因此临（lín）床试验方案中（zhōng）依据EMQN关（guān）于《SMA分（fèn）子诊（zhěn）断最（zuì）佳实践指南》，采用（yòng）了（le）国（guó）内外SMA体外（wài）辅（fǔ）助（zhù）分子（zǐ）诊断领域公认（rèn）的PCR-RFLP法作为对照方法（fǎ）。临床试验共完成1069例，其（qí）中正常对照组777例，SMA病例组292例，统计分析结果显示申（shēn）报产品与对比方法（fǎ）检测结（jié）果的一致性（xìng）为（wéi）100%（95%置信区间：99.66%～100%）。此外（wài），9747例正常成年人大（dà）样（yàng）本中目标外显（xiǎn）子△△Ct分布范（fàn）围的调查亦显示，该（gāi）产品的纯合突变判断界值设置合理。

　　该试剂目前批准的预期用途仅包含纯（chún）合缺失的检（jiǎn）测，尚不能用于杂合（hé）缺失的检测，因此无法用于SMA携（xié）带者的筛查，这是该产品的缺陷之一（yī）。

　　事（shì）实上，该产品在设计上已考虑到SMA携带者的检测，其检测（cè）原理是以待测样本中目标外显子荧光信号Ct值与（yǔ）内（nèi）参基因（yīn）荧光信（xìn）号Ct值之差（△Ct_s），与正常对照品三个梯（tī）度稀释品（pǐn）中目标外显子（zǐ）荧光信号Ct值和内参基因荧光（guāng）信号Ct值（zhí）之差的（de）平均值（zhí）（△Ct_a）之差，即△△Ct，作为待（dài）测（cè）样（yàng）本中目标外（wài）显子拷（kǎo）贝数检测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据（jù）实（shí）时荧光定量PCR相对定量的基本数学原理推导得（dé）到申报产品检测变量△△Ct的计算公式，依据这一计算（suàn）公式可（kě）推（tuī）导出纯合缺失、杂（zá）合缺失和野生型的（de）△△Ct理论值（或范围）；再结（jié）合目（mù）标外（wài）显子（zǐ）与内参（cān）基因扩增效（xiào）率（lǜ）差异以及（jí）SMN2不同拷贝数的影响（xiǎng），可对上述（shù）△△Ct理论值进（jìn）行优化。结果显示纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct值（或（huò）范围（wéi））之间（jiān）可（kě）设置合理的判断界值，因（yīn）此理论上该产品可分别（bié）检测出三种基因状态。但鉴于生产企业对杂合缺（quē）失与野生型之间的判断（duàn）界值（zhí）研究尚不透彻（chè），再加上（shàng）缺乏可判定杂合缺失的对（duì）比方法等（děng）其他困难，本次注册申（shēn）请的预（yù）期用途仅限（xiàn）于检测纯合突变，即（jí）SMA患者辅（fǔ）助诊断。

　　综（zōng）上，SMN1基（jī）因外显（xiǎn）子缺失检测（cè）在SMA疾病诊（zhěn）断和SMA携带者筛查（chá）中（zhōng）具有重要（yào）的（de）临（lín）床价值。然而到目前为止，受（shòu）到技术水平的限制，相关的体外（wài）诊断试剂比（bǐ）较缺乏，特别是可用于SMA携带者筛（shāi）查的杂合（hé）缺（quē）失（shī）检测（cè），尚无适（shì）合的体外诊断试剂上市。（器审中（zhōng）心审评六（liù）部  何静（jìng）云）

来源：中国医药报